ຄູ່ມືສຳລັບຫ້ອງທົດລອງກ່ຽວກັບການດຳເນີນການການທົດລອງ ELISA Kit ໃຫ້ສຳເລັດຜົນ

ຄູ່ມືຫ້ອງທົດລອງສຳລັບການຈັດຕັ້ງປະຕິບັດການທົດລອງ ELISA ໃຫ້ສຳເລັດຜົນ

ຄຸນນະພາບຂອງຜົນໄດ້ຮັບ ELISA ຂຶ້ນກັບຄວາມເປີດເຜີຍຫຼາຍກວ່າຄວາມເປີດເຜີຍ, ແຕ່ຂຶ້ນກັບຄວາມຖືກຕ້ອງໃນການປະຕິບັດແຕ່ລະຂັ້ນຕອນ. ການ ELISA kit — ເປັນທີ່ຮູ້ຈັກຢ່າງກວ້າງຂວາງວ່າ Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kit — ໃຫ້ຮູບແບບທີ່ມາດຕະຖານ ແລະ ສາມາດເຮັດຊ້ຳຄືນໄດ້ເພື່ອການວັດແທກປະລິມານຂອງໂປຣຕີນ, cytokines, ຮໍໂມນ ແລະ ອື່ນໆທີ່ເປັນສານຊີວະພາບໃນຕົວຢ່າງທີ່ແຕກຕ່າງກັນ. ການຮູ້ວ່າຊຸດເຄື່ອງມືນີ້ປະກອບດ້ວຍຫຍັງເປັນເພີຍງເລີ່ມຕົ້ນເທົ່ານັ້ນ. ການເຂົ້າໃຈ ແນວໃດ ວິທີການຈັດຕັ້ງປະຕິບັດການທົດລອງຢ່າງຖືກຕ້ອງ ແມ່ນສິ່ງທີ່ເຮັດໃຫ້ຂໍ້ມູນທີ່ຊັດເຈນແຕກຕ່າງຈາກຈານທີ່ເຕັມໄປດ້ວຍສັນຍານທີ່ບໍ່ຊັດເຈນ.

ຄູ່ມືນີ້ຈະນຳທ່ານໄປທົ່ວຂະບວນການທັງໝົດຂອງການທົດລອງ ELISA — ເລີ່ມຈາກການເຕີມເຕັມຄວາມພ້ອມຈົນເຖິງການວິເຄາະຂໍ້ມູນ — ໂດຍກວມເອົາທັງ ຊຸດເຄື່ອງມື ELISA ແບບ sandwich ແລະ ຊຸດເຄື່ອງມື ELISA ແບບ competitive ທີ່ອີງໃສ່ເທັກໂນໂລຊີ.

ຂັ້ນຕອນທີ 1: ເລືອກຮູບແບບຊຸດເຄື່ອງມື ELISA ທີ່ເໝາະສົມສຳລັບສານທີ່ທ່ານຕ້ອງການວັດແທກ

ກ່ອນທີ່ຈະເຮັດການດູດຕົວຢ່າງຄັ້ງດຽວ, ທ່ານຈຳເປັນຕ້ອງຢືນຢັນວ່າຮູບແບບຂອງຊຸດເຄື່ອງມືສອດຄ່ອງກັບເປົ້າໝາຍທີ່ທ່ານຕ້ອງການວິເຄາະ ແລະ ເປົ້າໝາຍທາງການທົດລອງ. ຮູບແບບສອງຊະນິດທີ່ໃຊ້ບໍ່ຫຼາຍກໍ່ເກີດຂຶ້ນບ່ອຍທີ່ສຸດມີການປະພຶດທີ່ແຕກຕ່າງກັນຫຼາຍ:

• ຊຸດ ELISA ຮູບແບບຊັ້ນຫຼາຍ: ເໝາະສຳລັບປະຕີເຊີນທີ່ມີຂະໜາດໃຫຍ່ ແລະ ໄຊໂທໄຄນ. ປະຕີເຊີນທີ່ເປັນເປົ້າໝາຍຈະຖືກຈັບຈອງໂດຍປະຕີເຊີນທີ່ຖືກເຄືອບຢູ່ໃນເວັດທະນະສາດ; ປະຕີເຊີນທີ່ໃຊ້ເພື່ອການກວດຈັບຈະຈັບຈອງກັບເປົ້າໝາຍທີ່ຕ່າງກັນໃນປະຕີເຊີນດຽວກັນ, ເຮັດໃຫ້ເກີດເປັນຮູບແບບ 'ຊັ້ນຫຼາຍ'. ຮູບແບບນີ້ໃຫ້ຄວາມເປັນເອກະລັກສູງ ແລະ ເປັນວິທີທີ່ຖືກນຳໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງທີ່ສຸດສຳລັບ ຊຸດ ELISA ສຳລັບໄຊໂທໄຄນ ເຊັ່ນ: IL-6, TNF-alpha, ແລະ IFN-gamma.
• ຊຸດ ELISA ຮູບແບບແຂ່ງຂັນ: ອອກແບບມາສຳລັບໂມເລກຸນທີ່ມີຂະໜາດນ້ອຍ ແລະ ປະຕີເຊີນທີ່ມີນ້ຳໜັກໂມເລກຸນຕ່ຳ — ມັກຈະຕ່ຳກວ່າ 10,000 Daltons — ເຊັ່ນ: ສະເຕີຣ໌ຣອຍ, ເປັບໄຕດ໌, ແລະ ຮໍໂມນທີ່ມີຂະໜາດນ້ອຍ. ໃນຮູບແບບນີ້, ປະຕີເຊີນຈາກຕົວຢ່າງຈະແຂ່ງຂັນກັບປະຕີເຊີນທີ່ຖືກຕິດປ້າຍກັບເປົ້າໝາຍທີ່ຈຳກັດ. ຖ້າຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງຕົວຢ່າງສູງ, ສັນຍານຈະຕ່ຳລົງ, ເຊິ່ງເປັນສິ່ງທີ່ກົງກັນຂ້າມກັບການທົດລອງຮູບແບບຊັ້ນຫຼາຍ.

ຖ້າທ່ານບໍ່ແນ່ໃຈວ່າຊุดຂອງທ່ານໃຊ້ຮູບແບບໃດ, ກະລຸນາກວດເບິ່ງຄຳແນະນຳທີ່ມີຢູ່ໃນຊຸດ ຫຼື ຂໍ້ມູນສະເພາະຂອງຜະລິດຕະພັນຈາກ ຜູ້ຜະລິດຊຸດ ELISA ສຳລັບມະນຸດ . ການຄິດໄລ່ຂໍ້ມູນໂດຍອີງໃສ່ຮູບແບບທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງຈະເຮັດໃຫ້ເສັ້ນເຄີບມາດຕະຖານທັງໝົດຂອງທ່ານບໍ່ຖືກຕ້ອງ.

ຂັ້ນຕອນທີ 2: ການເຕີມເຕັມກ່ອນການທົດສອບ

ການຂ້າມຂັ້ນຕອນການເຕີມເຕັມເປັນໜຶ່ງໃນສາເຫດທີ່ພົບເຫັນບໍ່ບໍ່ເທົ່າທຽບກັນທີ່ພົບເຫັນເລື້ອຍທີ່ສຸດ. ກະລຸນາໃຫ້ເວລາຢ່າງໜ້ອຍ 30 ນາທີກ່ອນເລີ່ມຕົ້ນ:

• ນຳເອົາສານທັງໝົດ – ລວມທັງມາດຕະຖານ, ອົງປະກອບທີ່ໃຊ້ໃນການຈັບຈ່ອງ, ແລະ streptavidin-HRP – ມາຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ (RT). ສານທີ່ມີອຸນຫະພູມຕ່ຳຈະເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມບໍ່ສົມ່ຳເສີມໃນການຈັບຈ່ອງ.
• ເຕີມເຕັມບຸຟເຟີເພື່ອລ້າງດ້ວຍການເຈືອຈາງສານເຂັ້ມຂຸ້ນຕາມຄຳແນະນຳຂອງຊຸດ. ບຸຟເຟີທີ່ເຮັດໄວ້ຫຼາຍວັນກ່ອນ ຫຼື ເກັບໄວ້ຢ່າງບໍ່ຖືກຕ້ອງອາດເຮັດໃຫ້ເກີດບັນຫາທີ່ເກີດຈາກການເຫຼືອຄ້າງ.
• ເຕີມເຕັມມາດຕະຖານທີ່ຈະໃຊ້ດ້ວຍການເຈືອຈາງຕາມລຳດັບ ໂດຍໃຊ້ສານເຈືອຈາງທີ່ໃຫ້ມາດ້ວຍ. ຊຸດສ່ວນຫຼາຍຈະມີມາດຕະຖານທີ່ມີຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງ ເຊິ່ງຕ້ອງເຈືອຈາງຢ່າງໜ້ອຍ 6–8 ຂັ້ນຕອນເພື່ອສ້າງເສັ້ນເຄີບມາດຕະຖານທີ່ຄົບຖ້ວນ.
• ກຽມຕົວຢ່າງຊີວະພາບທັງໝົດ: ທຳລາຍຕົວຢ່າງທີ່ເຢັນແຂງຢູ່ເທິງນ້ຳກ້ອນ, ໃຊ້ເຄື່ອງສູບຖອນເພື່ອເອົາເຊລລູລາທີ່ເສຍຫາຍອອກຖ້າຈຳເປັນ, ແລະ ປະສົມດ້ວຍຕົວຢ່າງທີ່ຖືກແນະນຳໃຫ້ໃຊ້ຖ້າຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ຄາດວ່າຈະເກີນຊ່ວງຂອງເສັ້ນໂຄງການມາດຕະຖານ.

ສົມມຸດວ່າຕົວປະສົມທີ່ທ່ານໃຊ້ແມ່ນເປັນຂອງຊຸດທີ່ໃຊ້ເປັນພິເສດ — ການເອົາຕົວປະສົມທົ່ວໄປມາໃຊ້ແທນໂດຍບໍ່ໄດ້ທົດສອບກ່ອນອາດຈະສົ່ງຜົນຕໍ່ປະສິດທິພາບຂອງການຈັບຄູ່ຢູ່ໃນທາງທີ່ບໍ່ສາມາດເຫັນໄດ້ຢ່າງຊັດເຈນຈາກຄ່າຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງແສງ.

ຂັ້ນຕອນທີ 3: ການເຄືອບຈານແລະການກັ້ນ

ສ່ວນຫຼາຍຂອງ ຊຸດ ELISA ຈະສົ່ງມາພ້ອມຈານທີ່ຖືກເຄືອບແລ້ວເຊິ່ງເປັນທີ່ທີ່ອັນຕີບອດຈັບຄູ່ໄດ້ຖືກເຊື່ອມຕິດຢູ່ທີ່ເທິງຜິວຂອງຮູ. ຖ້າຊຸດຂອງທ່ານປະກອບດ້ວຍຈານທີ່ບໍ່ໄດ້ເຄືອບແລະອັນຕີບອດຈັບຄູ່ທີ່ແຍກຕ່າງຫາກ, ທ່ານຈະຕ້ອງເຄືອບຈານດ້ວຍຕົວເອງ:

1. ປະສົມອັນຕີບອດຈັບຄູ່ໃນຕົວເຄືອບເພື່ອໃຫ້ໄດ້ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຕາມທີ່ກຳນົດໄວ້ໃນຄູ່ມືຂອງຊຸດ.
2. ເຕີມ 100 ມິກໂຣລິດເຕີ ຕໍ່ຮູ ແລະ ເກັບໄວ້ເປັນເວລາ 1 ຄືນທີ່ 4°C, ຫຼື 2 ຊົ່ວໂມງທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງດ້ວຍການເຂື່ອນຢ່າງເບົາ.
3. ລ້າງຈານ 3 ຄັ້ງດ້ວຍບຸຟເຟີ້ລ້າງເພື່ອກຳຈັດອັນຕີບອດີທີທີ່ບໍ່ໄດ້ຈັບຢູ່. ການລ້າງບໍ່ຄົບຖ້ວນໃນຂັ້ນຕອນນີ້ຈະເຫຼືອອັນຕີບອດີທີທີ່ຈັບຢູ່ເຊິ່ງອາດເຮັດໃຫ້ຄ່າພື້ນຫຼັງສູງຂຶ້ນ.
4. ປິດການຈັບດ້ວຍການເຕີມບຸຟເຟີ້ລະລາຍຕົວຢ່າງ ຫຼື ບຸຟເຟີ້ລີ້ນການປິດ (blocking buffer) ຈຳນວນ 200–300 ມິກໂຣລິດເຕີ ຕໍ່ຮູ. ປ່ອຍໃຫ້ຢູ່ທີ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງເປັນເວລາ 1–2 ຊົ່ວໂມງ. ການປິດນີ້ຊ່ວຍປ້ອງກັນການຈັບທີ່ບໍ່ເຈາະຈົງຂອງໂປຼຕີນຕໍ່ຜິວໜ້າຈານ.
5. ລ້າງອີກ 3 ຄັ້ງກ່ອນຈະເລີ່ມຂັ້ນຕອນການເຕີມຕົວຢ່າງ.

ຊຸດທີ່ມີຈານທີ່ເຄືອບລ່ວງໆ ຈະຂ້າມໄປເຖິງຂັ້ນຕອນການປິດ ຫຼື ຂັ້ນຕອນການເຕີມຕົວຢ່າງທັນທີ — ອ່ານຄຳແນະນຳເພື່ອການໃຊ້ງານຂອງຊຸດທີ່ທ່ານໃຊ້ຢ່າງລະອຽດ, ເນື່ອງຈາກຂັ້ນຕອນອາດແຕກຕ່າງກັນໄປຕາມຜູ້ຜະລິດ.

ຂັ້ນຕອນທີ 4: ການປ່ອຍໃຫ້ຕົວຢ່າງ ແລະ ມາດຕະຖານຢູ່ຮ່ວມກັນ

ນີ້ແມ່ນຈຸດທີ່ເກີດເຫດການການຈັບຈໍາ. ເພີ່ມມາດຕະຖານ ແລະ ຕົວຢ່າງທີ່ທ່ານໄດ້ກຽມໄວ້—ໂດຍທົ່ວໄປແມ່ນ 100 µL ຕໍ່ບໍ່ລູກ—ແລ້ວປິດສະຫຼັບຈານດ້ວຍຟີມຢາດຕິດ. ເກັບໄວ້ໃນອຸນຫະພູມປົກກະຕິເປັນເວລາ 2 ຊົ່ວໂມງ ຫຼື ຄືນໜຶ່ງທີ່ 4°C, ຂຶ້ນກັບເງື່ອນໄຂທີ່ໄດ້ຮັບການຢືນຢັນຂອງຊຸດເຄື່ອງທີ່ທ່ານໃຊ້.

ຈາກປະສົບການຂອງຂ້ອຍໃນການສັງເກດການໃຊ້ຊຸດ ELISA ເດີມກັນສຳລັບ cytokine ໃນຫຼາຍໆສະຖາບັນທີ່ເງື່ອນໄຂແຕກຕ່າງກັນ, ແຫຼ່ງທີ່ສຳຄັນທີ່ສຸດຂອງຄວາມແຕກຕ່າງລະຫວ່າງຫ້ອງທົດລອງບໍ່ມັກຈະເປັນຊຸດເຄື່ອງເອງ—ແຕ່ເປັນຄວາມບໍ່ສອດຄ່ອງຂອງເວລາ ແລະ ອຸນຫະພູມໃນການເກັບໄວ້ລະຫວ່າງການທົດລອງ. ຖ້າຈານຂອງທ່ານຖືກເກັບໄວ້ທີ່ອຸນຫະພູມທີ່ແຕກຕ່າງກັນເລັກນ້ອຍໃນແຕ່ລະມື້, ແຖວມາດຕະຖານຂອງທ່ານຈະເລື່ອນໄປ, ເຮັດໃຫ້ການປຽບທຽບລະຫວ່າງການທົດລອງເປັນເລື່ອງຍາກ. ມາດຕະຖານສຳຄັນທີ່ຕ້ອງຮັກສາໄວ້: ຄ່າ CV ພາຍໃນການທົດລອງ (intra-assay) ຄວນຕ່ຳກວ່າ 10%, ແລະ ຄ່າ CV ລະຫວ່າງການທົດລອງ (inter-assay) ຄວນຕ່ຳກວ່າ 15%.

ຫຼັງຈາກເກັບໄວ້, ລ້າງດ້ວຍນ້ຳລ້າງ 3–5 ຄັ້ງ. ການລ້າງຢ່າງທົ່ວຖ້ວນແມ່ນສຳຄັນຫຼາຍ: ສານປະກອບທີ່ບໍ່ຖືກຈັບຈໍາທີ່ຍັງເຫຼືອຢູ່ໃນບໍ່ລູກຈະແຂ່ງຂັນກັບ antibody ທີ່ໃຊ້ໃນການຈັບຈໍາ ແລະ ຈະເຮັດໃຫ້ສັນຍານພື້ນຖານສູງຂຶ້ນ.

ຂັ້ນຕອນທີ 5: ການກວດຫາ antibody ແລະ ການເພີ່ມສັນຍານ

ສໍາລັບ ຊຸດເຄື່ອງມື ELISA ແບບ sandwich , ຂັ້ນຕອນຕໍ່ໄປຈະປະກອບດ້ວຍ antibody ທີ່ໃຊ້ກວດຫາ ແລະ ເອນໄຊມ໌ທີ່ໃຊ້ເພີ່ມສັນຍານ:

1. ເຕີມ antibody ທີ່ໃຊ້ກວດຫາ (ມັກຈະຖືກປ່ຽນເປັນ biotinylated) ດ້ວຍຄວາມເຂັ້ມຂຸ່ນທີ່ກຳນົດໄວ້ໃນຄູ່ມືຂອງຊຸດທົດສອບ — ໂດຍທົ່ວໄປແມ່ນ 100 µL ຕໍ່ຮູ
2. ລ້າງ 3–5 ຄັ້ງເພື່ອເອົາ antibody ທີ່ບໍ່ໄດ້ຈັບກັບເປົ້າໝາຍອອກ
3. ເຕີມ Streptavidin-HRP conjugate. ປ່ອຍໃຫ້ຢູ່ 20–30 ນາທີ ຢູ່ອຸນຫະພູມປົກກະຕິ, ໂດຍປ້ອງກັນຈາກແສງແດດໂດຍກົງ
4. ລ້າງອີກຄັ້ງ 5 ຄັ້ງ. ໃນຂັ້ນຕອນນີ້, ການລ້າງຢ່າງລະອອນແມ່ນສຳຄັນເປັນພິເສດ ເນື່ອງຈາກວ່າ HRP ທີ່ເຫຼືອຈະເຮັດໃຫ້ສັນຍານສຸດທ້າຍຂອງທ່ານເພີ່ມຂຶ້ນ

ສໍາລັບ ຊຸດເຄື່ອງມື ELISA ແບບ competitive , ວິທີການກວດຫາຈະແຕກຕ່າງກັນ — ອັນຕີເຈັນທີ່ຖືກຕິດປ້າຍ ແລະ ອັນຕີເຈັນຈາກຕົວຢ່າງຈະຖືກເຕີມເຂົ້າໄປດ້ວຍ antibody ໃນເວລາດຽວກັນ. ຕາມຄູ່ມືຂອງຊຸດທົດສອບທີ່ອີງໃສ່ຮູບແບບການແຂ່ງຂັນຢ່າງເຂັ້ມງວດ, ເນື່ອງຈາກລຳດັບຂັ້ນຕອນ ແລະ ຄວາມເຂັ້ມຂຸ່ນໄດ້ຖືກປັບຄ່າໄວ້ຕ່າງກັນ

ຂັ້ນຕອນທີ 6: ການເຕີມ substrate, ຢຸດການປະຕິກິລິຍາ, ແລະ ການອ່ານຜົນຈາກຈານ

ເພີ່ມ TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) substrate ຈຳນວນ 100 µL ເຂົ້າໄປໃນແຕ່ລະບໍ່. ປ່ອຍໃຫ້ຢູ່ໃນທີ່ມືດເປັນເວລາ 15–30 ນາທີ. ສີຟ້າຈະເກີດຂຶ້ນໃນບໍ່ທີ່ມີ HRP ຜູກຢູ່ — ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງສີສຳທົດກັບຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ analyte ໃນຮູບແບບ sandwich.

• ຢຸດປະຕິກິລິຍາດ້ວຍການເພີ່ມ stop solution (ມັກຈະເປັນ sulfuric acid ຄວາມເຂັ້ມ 2N) ຈຳນວນ 50 µL ເຂົ້າໄປໃນແຕ່ລະບໍ່ຕາມລຳດັບ ແລະ ເວລາດຽວກັນກັບທີ່ທ່ານເພີ່ມ substrate. ການຢຸດປະຕິກິລິຍາທີ່ບໍ່ເປັນລຳດັບຈະເຮັດໃຫ້ຄ່າ OD ບໍ່ຖືກຕ້ອງລະຫວ່າງບໍ່ຕ່າງໆ.
• ອ່ານຜົນຈາກຈານເປັນເວລາພາຍໃນ 30 ນາທີຫຼັງຈາກຢຸດປະຕິກິລິຍາ ໂດຍໃຊ້ microplate reader ຢູ່ຄວາມຍາວຄລື່ນ 450 nm. ໃຊ້ຄວາມຍາວຄລື່ນ 570 nm ເປັນຄວາມຍາວຄລື່ນອ້າງອີງເພື່ອປັບຄ່າສຳລັບຂໍ້ບົກພ່ອງດ້ານ quang ຂອງຈານ.

ຖ້າທ່ານກຳລັງໃຊ້ຊຸດເຄື່ອງມືຈາກຜູ້ຜະລິດທີ່ເຊື່ອຖືໄດ້ ຜູ້ຜະລິດຊຸດ ELISA ສຳລັບມະນຸດ , stop solution ແລະ substrate ໄດ້ຖືກທົດສອບແລ້ວວ່າເຂົ້າກັນໄດ້ດີ. ການເລືອກໃຊ້ substrate ຫຼື stop solution ອື່ນຈະເຮັດໃຫ້ຄວາມຍາວຄລື່ນທີ່ໃຊ້ໃນການວັດແທກເปลີ່ນແປງ ຫຼື ເຮັດໃຫ້ສັນຍານບໍ່ເປັນເສັ້ນຊື່.

ຂັ້ນຕອນທີ 7: ການຄຳນວນ ແລະ ຕີຄວາມໝາຍຂອງຂໍ້ມູນ

ໃຊ້ເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານເພື່ອຄຳນວນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ analyte ໃນຕົວຢ່າງຂອງທ່ານ:

1. ແຜນວາດເສັ້ນສະຕານດາດ: ຄ່າ OD (ແກນ y) ເທີບຽບກັບຄ່າຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ຮູ້ຈັກ (ແກນ x). ການຊຸດເຄື່ອງມືສ່ວນຫຼາຍແນະນຳໃຫ້ໃຊ້ການປັບເສັ້ນໂຄງການ 4 ປັດໄຈ (4PL) ສຳລັບຮູບແບບ ELISA ທີ່ເປັນຊັ້ນ.
2. ຢືນຢັນວ່າຄ່າ R² ຂອງເສັ້ນສະຕານດາດຕ້ອງເທົ່າກັບຫຼືຫຼາຍກວ່າ 0.99 ກ່ອນຈະນຳໃຊ້ເພື່ອຄຳນວນຄ່າຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງຕົວຢ່າງຄືນໃໝ່.
3. ຕົວຢ່າງທີ່ຢູ່ນອກເຂດຂອງເສັ້ນສະຕານດາດຕ້ອງຖືກທົດສອບຄືນໃໝ່ດ້ວຍການເຈືອຈາງທີ່ເໝາະສົມ. ການຄາດເດົາຄ່າທີ່ຢູ່ນອກຈຸດສິ້ນສຸດຂອງເສັ້ນສະຕານດາດຈະໃຫ້ຂໍ້ມູນທີ່ບໍ່ເຊື່ອຖືໄດ້.
4. ຄູນຄ່າຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນທີ່ຄຳນວນໄດ້ດ້ວຍປັດໄຈການເຈືອຈາງທີ່ນຳໃຊ້ໃນຂະບວນການກຽມຕົວຢ່າງ.

ເບື້ອງຕົ້ນ, ຫຼາຍຫ້ອງທົດສອບມຸ່ງເນັ້ນເພີ່ງພາຄວາມອ່ອນໄຫວເທົ່ານັ້ນ — ຄວາມ ELISA kit ຈຸດຕ່ຳສຸດທີ່ສາມາດກວດພົບໄດ້ສຳລັບການວິເຄາະ cytokine ສະເພາະໃດໜຶ່ງ ມັກຖືກອ້າງອີງວ່າຕ່ຳກວ່າ 10 pg/mL. ແຕ່ໃນທາງປະຕິບັດ, ຄວາມເປັນເອກະລັກກໍມີຄວາມສຳຄັນເທົ່າກັບ: ວ່າຄູ່ຂອງ antibody ນັ້ນມີການຕອບສະຫນອງຂ້າມກັບໂປຣຕີນທີ່ມີໂຄງສ້າງຄ້າຍຄືກັນໃນຕົວຢ່າງຂອງທ່ານຫຼືບໍ່ ຈະສົ່ງຜົນໂດຍກົງຕໍ່ຄວາມຖືກຕ້ອງຂອງຜົນໄດ້ຮັບຂອງທ່ານ. ຊຸດທີ່ໄດ້ຮັບການຢືນຢັນສຳລັບເຊີຟີມຂອງມະນຸດອາດຈະໃຫ້ຜົນໄດ້ຮັບທີ່ບໍ່ສອດຄ່ອງກັນ ຖ້າທ່ານນຳໃຊ້ມັນກັບນ້ຳລ້ຽງເຊື້ອທີ່ເຕີບໂຕໃນຈານໂດຍບໍ່ໄດ້ຢືນຢັນຄ່າການເຈືອຈາງໃໝ່ສຳລັບຕົວຢ່າງແບບນີ້.

ຂໍ້ຜິດພາດທີ່ເກີດຂື້ນເລື້ອຍໆ ທີ່ເຮັດໃຫ້ຜົນໄດ້ຮັບບໍ່ຖືກຕ້ອງ

ມີບາງການເບິ່ງຂ້າມຂັ້ນຕອນທີ່ເກີດຂື້ນເລື້ອຍໆ:

• ການລ້າງທີ່ບໍ່ເປັນເອກະພາບ: ການດູດອອກທີ່ບໍ່ທົ່ວຖື້ນຈະເຫຼືອບຸຟເຟີເຫຼືອຢູ່ໃນຮູ ເຊິ່ງຈະເຮັດໃຫ້ເຄື່ອງມືທີ່ເພີ່ມຕໍ່ໄປຖືກເຈືອຈາງ. ຄວນໃຊ້ປີ້ນທີ່ມີຫຼາຍຊ່ອງ ຫຼື ເຄື່ອງລ້າງຈານ ຖ້າຄວາມສາມາດໃນການປະມວນຜົນອະນຸຍາດ.
• ຟອງອາກາດໃນຮູ: ຟອງອາກາດຈະສົ່ງຜົນຕໍ່ການພັດທະນາສີຂອງ TMB — ຄວນແຕະຈານຢ່າງເບົາໆຫຼັງຈາກເຕີມຂອງเหลວແຕ່ລະຄັ້ງ.
• ການເຢັນແລ້ວເຮັດໃຫ້ເປັນນ້ຳໃໝ່ຫຼາຍຄັ້ງຕໍ່ຕົວຢ່າງ: ການເຢັນແລ້ວເຮັດໃຫ້ເປັນນ້ຳໃໝ່ຫຼາຍຄັ້ງຈະເຮັດໃຫ້ໂປຣຕີນເສື່ອມສະພາບ ແລະ ລົດຈະນ້ອຍລົງໃນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ antigen ທີ່ສາມາດກວດພົບໄດ້. ຄວນແບ່ງຕົວຢ່າງເປັນສ່ວນໆກ່ອນຈະເຢັນ.
• ການຂ້າມຂັ້ນຕອນການໃຫ້ເຄື່ອງມືຄືນສູ່ອຸນຫະພູມຫ້ອງ: ການເພີ່ມວັດຖຸເຄມີທີ່ເຢັນລົງໃນຈານທີ່ມີອຸນຫະພູມປົກກະຕິ ຈະເຮັດໃຫ້ເກີດຄວາມແຕກຕ່າງຂອງອຸນຫະພູມ ເຊິ່ງສົ່ງຜົນຕໍ່ອັດຕາການຈັບຄູ່ຂອງອະນຸພາວະຢ່າງບໍ່ເທົ່າທຽມກັນທົ່ວທັງຈານ.
• ການຈຳແນກຮູບແບບຊຸດເຄື່ອງມືຜິດ: ການນຳໃຊ້ສູດເສັ້ນໂຄ້ງມາດຕະຖານຂອງວິທີການ ELISA ປະເພດ sandwich ກັບຜົນໄດ້ຮັບຈາກຊຸດເຄື່ອງມື ELISA ປະເພດ competitive ຈະເຮັດໃຫ້ການຕີຄວາມຫມາຍຂອງທ່ານກົງຂ້າມ — ສັນຍານທີ່ສູງຈະຖືກຕີຄວາມວ່າເປັນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນສູງ ເຖິງແນວໃດກໍຕາມ ຄວາມຈິງແມ່ນກົງຂ້າມ.

ການດຳເນີນການທົດສອບ ELISA ໃຫ້ສຳເລັດຜົນ ແມ່ນທັກສະທີ່ພັດທະນາຜ່ານການປະຕິບັດຢ່າງຖືກຕ້ອງຊົ້າໆ ກັນ. ຖ້າຊຸດເຄື່ອງມືທີ່ທ່ານກຳລັງໃຊ້ຢູ່ນີ້ໃຫ້ຜົນໄດ້ຮັບທີ່ປ່ຽນແປງໄປມາ ເຖິງແນວໃດກໍຕາມທ່ານຈະໄດ້ປະຕິບັດຢ່າງລະມັດລະວັງແລ້ວ, ອາດຈະເຖິງເວລາທີ່ຈະປະເມີນຄວາມເໝາະສົມຂອງຂໍ້ກຳນົດຂອງຊຸດເຄື່ອງມືນີ້ — ຄວາມໄວ, ມາຕຣິກເຊີທີ່ໄດ້ຮັບການຢືນຢັນ, ແລະ ຂໍ້ມູນກ່ຽວກັບການຕອບສະຫນອງຂອງອະນຸພາວະຕໍ່ກັນ — ວ່າເຫມາະສົມກັບອະນຸພາວະ ແລະ ປະເພດຕົວຢ່າງທີ່ທ່ານກຳລັງທົດສອບຫຼືບໍ່. ການຈັດຫາຈາກຜູ້ສະໜອງທີ່ມີຄວາມເໝາະສົມ ຜູ້ຜະລິດຊຸດ ELISA ສຳລັບມະນຸດ ທີ່ມີຂໍ້ມູນການຢືນຢັນຄວາມສອດຄ່ອງລະຫວ່າງລຸກ (lot-to-lot) ຈະເຮັດໃຫ້ການແກ້ໄຂບັນຫາງ່າຍຂຶ້ນຫຼາຍ, ເນື່ອງຈາກທ່ານສາມາດເປີຽບเทີບຜົນໄດ້ຮັບຂອງທ່ານກັບເສັ້ນຖານທີ່ຮູ້ຈັກແລ້ວ ແທນທີ່ຈະເດົາວ່າຕົວແປໃດທີ່ປ່ຽນແປງ.