ЭЛИСА цуглуулмын шинжилгээг амжилттай гүйцэтгэх лабораторийн заавар.

Амжилттай элиса цуглуур шинжилгээ хийх лабораторийн заавар

Элиса-ийн үр дүнгийн чанар нь таамаглалд бага хамаарч, илүүтдүүр тусгай алхам бүрийн нарийн гүйцэтгэлд хамаарна. Нэг ELISA хайрцаг — фермент холбогдсон иммуносорбент шинжилгээний цуглуур — олон төрлийн сорилтын матрицаас тодорхой уургийн, цитокинуудын, даавруудын болон бусад биологийн шинжилгээний зүйлсийн тооцоог хийх үүрдүүр, давтамжит форматыг үзүүрлэн өгдөг. Цуглуурт юу багтаж буйг мэдэх нь зөвхөн анхны алхам. Ойлгох хэрхэн шинжилгээг зөвхөн хийх арга нь цэвэр өгөгдлийн олонлогт хүрэх үүрдүүр бөөрсөг дохионы хоорондын ялгаа.

Энэ заавар нь бүтнэд нь элиса шинжилгээний үйлдлийн дарааллыг — бэлдмүүртснээс хойш өгөгдлийн шинжилгээ хүртэл — хамрах ба хоёр талт элиса цуглуур ба үлдэцдүүр элиса цуглуур форматуудын хувьд бүтэн хувийн тохируулж өгсөн.

Алхам 1: Шинжилгээний зүйлд тохирох элиса цуглуур хэлбэрийг сонгох

Нэг дээжийн хүртэл пипеткалахын өмнө та комплектын хэлбэр нь таны шинжилж буй бодис ба туршилтын зорилгоос харгалзан тохирохыг баталж үзэх ёстой. Хамгийн түгээмүүр хоёр хэлбэр нь их хооронд ялгаатай үйлчилнэ:

• Сандвич ELISA комплект: Их молекул жингийн уураг, цитокин зэрэг бодисуудын шинжилгээнд тохиромжтой. Планшет дээр бүрхүүлсэн баримтлагч сорилт антителоны тусламжтайгаар таны зорилгоос хамаарах антиген холбогдож, дараа нь илрүүлэх сорилт антителоны тусламжтайгаар түүн дээрх өөр эпитопт холбогдож, «сандвич» үүсгэнэ. Энэ хэлбэр нь өндөр тодорхойлолт үзүүлдэг бөлөг, ажиглалт нь цитокинуудын ELISA комплектуудад хамгийн түгээмүүр арга. Цитокинуудын ELISA комплект жишээ нь IL-6, TNF-альфа, IFN-гамма.
• Төрөлхийн ELISA комплект: Жижиг молекул, бага молекул жингийн антигенууд — ерөнхийдөө 10 000 Дальтон доор — стероид, пептид, жижиг гормон зэрэг бодисуудын шинжилгээнд зориулж бүтээдэг. Энэ хэлбэрт дээжийн антиген лабелд антиген соёлтой хязгаарлагдмүүр антителоны холбогдох суурин дээрх хөршлөлд оролцож, дээжийн концентраци өсөх тусам сигнал бүүр бүүр сулардаг, үүн нь сандвич шинжилгээнд харин урвуу харьцаа.

Та ямар форматын хайрцаг ашиглаж буйг магадгүй сүүлд тодорхойлохын тулд хайрцгийн доторх зааврыг эсвэл таны хүний ELISA хайрцгийн үйлдвэрлэгч дээрх бүтээдийн техникийн үзүүлэлтүүдийг шалгана уу. Өгөгдлийн тооцоололд буруу форматын таамаглалыг ашиглах нь та нарын бүх стандарт муруйг хүчингүй болгоно.

2-р алхам: Сорилт өмнөх бэлдэл

Бэлдэл хийхгүй үлдээх нь хамгийн түгээмпүүр хувьсах хүчин зүйлсийн нэг юм. Сорилт үлдээх үед дор хаяж 30 минутын өмнөх бэлдэл хийнэ уу:

• Стандартууд, илрүүлэх сорилт, стрептавидин-HRP гэх мэт бүх реагентуудыг өрөөний температурт (RT) авчирна уу. Хүйтэн реагентууд нь тогтвортой бүрхүүл үүсгэх кинетикыг үүсгэнэ.
• Хайрцгийн зааврын дагуу концентратыг сүүдлүүр буферт хийж шинэ сүүдлүүр буфер бэлднүүр. Хоногуудын өмнө бэлдсэн буфер эсвэл буферийн хадгалалт нь хүчингүй үлдээх артефактуудыг үүсгэнэ.
• Та өгөгдсөн сүүдлүүр буферт стандартуудыг дараалан сүүдлүүрлүүр. Ихэнх хайрцгууд өндөр концентрацид бүх стандарт муруйг бүрдүүлэхийн тулд дор хаяж 6–8 сүүдлүүрлүүр цэгүүд шаардууд.
• Бүх биологийн соринцүүдийг бэлд: хөлдүүр соринцүүдийг мөс дээр талж, шаардлагатай тохиолдолд нүүрсний хэсгүүдийг таслахын тулд центрифугаар бүртгүүл, стандарт муруйн хүрээнд хүлээж буй концентраци үлдмүүр хэтрүүлж буй тохиолдолд соринцүүдийг зөвлөмүүр соринцүүдийн зөөлөнгүүрт уусгагчид хаяж зөөлөнгүүрт.

Та үлдмүүр уусгагч нь хайрцагт тодорхойлсон — түүнийг шууд орлуулж, түүнийг анхны шалгахгүйгээр ердийн уусгагчид хаяж, оптикийн нягтын уншлугчид илтгэж буй үр дүнд нөлөөлж буй холбогдож буй чадварыг үлдмүүр хоосонгүй газар хүлээж буй.

Алхам 3: Давхарга хийж, хаалт хийж

Ихэнх коммерци ELISA хайрцагт урьдчилан давхаргатай самбаруудтай хүргүүлд, хүлээж буй антибоди нь аль хойно самбарын гадаргууд холбогдож буй. Хэрвээ та хайрцагт хүлээж буй самбарууд ба тусдаа хүлээж буй антибоди орлуулж буй тохиолдолд, та самбаруудыг өөрсдийнхөөр хийж буй:

1. Хүлээж буй антибоди нь давхарга уусгагчид хайрцагт тодорхойлсон концентрацт уусгагчид хаяж зөөлөнгүүрт.
2. Нэг нүх рүү 100 µL хаяж, 4°C-д шөнө туршид, эсвэл өрөөн температурт 2 цаг туршид тайван хөдөлгүүрт инкубаци хийж буй.
3. Холбогдоогүй сорилт бүүрхүүнийг угаах буфер-аар 3 удаа угаана, хүртэл бүүрхүүн холбогдоогүй үлдмүүрсийн төлөөлөх сорилт бүүрхүүн устах. Хүртэл бүүрхүүн устахгүй үлдмүүрсийн төлөөлөх сорилт бүүрхүүн ард фонг нэмэгдүүр.
4. Сорилт шингэн хийж, бүүрхүүн дүүрүүлнэ — бүүрхүүн дүүрүүлэх шингэн юм уу бүүрхүүн дүүрүүлэх буфер-аар 200–300 µL хийж, 1–2 цаг хугацаанд өрөөн температурт инкубаци хийнэ. Бүүрхүүн дүүрүүлэх нь бүүрхүүн гадаргууд неспецифик уургийн холбогдохыг саатуулна.
5. Дараа нь сорилт нэмэх үед хүртэл дахин 3 удаа угаана.

Урьдчилан бүүрхүүнд хийсэн сорилт хайрцагууд нь шууд бүүрхүүн дүүрүүлэх юм уу сорилт нэмэх алхамд орж, та өөрийн сорилт хайрцагуудын тодорхой зааврыг сайн уншиж, үйлдвэрлэгчдийн хооронд алхамууд ялгаатай байдаг.

4-р алхам: Сорилт ба стандарт инкубаци

Түүвэрлэх үйлдэл үүнд хийгддэг. Бэлдсэн стандартуудын та ийнхүү дурьдаж буй шиг нэмж, адгезив фольгоор саванга бүрхнү. Хөрөнгөн температурт 2 цаг, эсвэл 4°C-т шөнө бүрхнү — та нарын китийн баталгаажуулж буй нөхцлүүдэд харш.

Миний туршлагаар, янз бүрийн байгууллагууд цитокинуудын ELISA китийг өөр өөр нөхцлүүдэд ажиллуулж буй үед лабораториудын хоорондын хувьсах бүрдүүлэлтийн гол урьдчилан тодорхойлж буй шалтгаан нь ихэвчлэн кит биш — харин туршилтуудын хооронд инкубацийн хугацаа болон температурт гарч буй тогтвортой бүсүүд биш. Хэрэв саванга та нарын өөр өөр өдрийн температурт бүрхнү, та нарын стандартын муруй шилжих бөгөөд туршилтуудын хоорондын харьцуулалт хийгдэхгүй. Тогтвортой бүсүүдийн чухал хэмжүүр: нутгийн туршилтунд CV утга 10%-аас доош, гадаад туршилтунд CV утга 15%-аас доош байх ёстой.

Инкубацийн дараа угаалтын буферт 3–5 удаа угаалт хийнү. Угаалт нь онцгой чухал: хоосон хүрдүүдэд үл холбогдсон түүвэрлэх уураг үлдмү, түүнээс бүрхнүн детекцийн сорилт антителоныг үл холбогдсон уургийн хамт үлдмү, үүнээс фон сигнал өсмү.

Алхам 5: Илрүүлэх сорилт бие ба сигналын нэмэгдүүлэлт

А элиса цуглуур , дараагийн алхамууд илрүүлэх сорилт бие ба сигналын ферменттэй холбоотой:

1. Илрүүлэх сорилт биет (ихэвчлэн биотинилжсэн) нь хайрцагт бүхлэд өгсөн концентрацид нэмэгдүүлэлт — ихэвчлэн нүх тутамд 100 µL. 1–2 цаг өрөөний температурт инкубируйте.
2. Холбоогүй илрүүлэх сорилт биет устгахын тулд 3–5 удаа угаана.
3. Стрептавидин-HRP холбоо нэмнө. Түүнийг шууд гэрлийн нөлөөнөөс хамгаалан 20–30 минут өрөөний температурт инкубируйте.
4. Дахин 5 удаа угаана. Энэ үед нарийн угаалт тусгайлан чухал, учир нь үлдсэн HRP идэвх нь та нарийн сигналыг өндөртгөхөөр хүчтэрнө.

А үлдэцдүүр элиса цуглуур , илрүүлэх ажиллагаа өөр бөлгөөн — шүлгийн дүрсэлсэн антиген ба сорилтын антиген нь сорилт биеттэй хамт нэмэгдүүлэлт. Хайрцагт өгсөн оролцоо-хэлбэрт протоколыг яг дагаж, дараалал ба концентрацид нь тодорхой тохируулалт хийсэн.

Алхам 6: Субстратын нэмэгдүүлэлт, урвалыг зогсоох, пластины уншилт

ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин) дэлгүүрт 100 мкл нэм. Харанхуйд 15–30 минут инкубируул. ХРП-т холбогдсон цөснүүд нь цэнхэр өнгөтэй болж, сандвич хэлбэрт аналитын концентраци үүний хүчирхүйлттэй шууд холбоотой.

• Реакцыг зогсоохын тулд субстратыг нэмснүүрт ижил дараалалд болон цагт 50 мкл зогсоох уусмал (ихэвчлэн 2N хүхрийн хүчлийн уусмал) нэм. Зогсоох цагт тааралдах гажиг нь цөснүүдийн оптико-денситометрийн уншлугаар хооронд хүнд хазайлт үүсгэнэ.
• Реакцыг зогсоосны дараа 30 минутын дотор микропластика уншигч дээр 450 нм-д уншиг. Пластикаас үүсгэх оптико гажигийг засахын тулд 570 нм-д түүний хүчирхүйлттэй харьцуул.

Хэрэв та хүндэтгэсэн хүний ELISA хайрцгийн үйлдвэрлэгч , зогсоох уусмал болон субстрат нь хослолт уусмалууд бөлгөөнөөр шалгагдаж, туршигдаж бөлгөөнөөр баталгааждаг. Өөр субстрат юм уу зогсоох уусмал орлуулж хийх нь та нарын детекцийн долгион урт ёсойн хувиралт юм уу сигналын шугаман хамаарлын өөрчлөлт үүсгэнэ.

7-р алхам: Өгөгдлүүдийн бодолт ба тайлбарлалт

Та стандартын муруйг ашиглан та нарын сэмплүүд дээрх аналитын концентрацийг бодож ол.

1. Стандартын муруйг зурах: OD (y тэнхлэг) vs. мэдэгдсэн концентраци (x тэнхлэг). Олонх хайрцагууд сэндвич ELISA форматын хувьд 4 параметрт логистик (4PL) муруйн тааруулалтыг санал болгож байдаг.
2. Самплуудын концентрацийг урвуу тооцоолохын өмнө стандартын муруйн R² утга ≥ 0.99 бөлгөөнүүр баталж үзэх.
3. Стандартын муруйн хязгаарын гадна орших самплуудыг тохирох шингэнд хийсэн зөөлрүүлэлтийн дараа дахин шинэчлэн туршилт хийх ёстой. Муруйн төгсгөлүүдийн гадна урвуу тооцоолох үр дүн итгэж болмуйн үр дүн үл үндэслэлтэй.
4. Тооцоолсон концентрацийг самплуудын бэлдмүүрт хийсэн зөөлрүүлэлтийн коэффициенттүүдээр үржүүлэх.

Анхны үед олонх лабораториуд бүтнээрх нь майтгүүр — ELISA хайрцаг тухайн цитокинийн шинжилгээний илрүүлэх хязгаар нь ихэвчлэн 10 пг/мЛ-с доош гэж заагддаг. Гэтэл практикт тодорхойлолт чинь ийнхүү чухал: тааны сорилтын матрицад бүтцийн хувьд төстэй уургүүдтэй хос антибодиуд хооронд хөндлөн харицадуулалт үүсгэх үү, тааны үр дүнгийн нарийн төвөгтэй бүтэн хамаарна. Хүний цусын сывороткын хувьд баталгаажуулсанаар хайрцаг хүний нүүрсний шингэнд ашиглаж болой, гэтэл та түүнийг нүүрсний шингэнд ашиглахын өмнө түүнийг тухайн матрицад дахин баталгаажуулж, зөв хийлтүүн хэмжээг тогтоож үзэх ёстой.

Үр дүнг муутгах түүнд тааралддаг алдаанууд

Хэдхэн протоколын хазайлт тааралддаг:

• Угаалт нь тогтмол бус: Төвөгтэй аспираци үлдсэн буферийн хүрээс дараагийн реагентүүдийн концентрацияг сулруулж, түүн дээр нь нөлөөлнө. Хэрэв хүчинтүүн хүрээс хүртэл хүртүүлж болой, олон каналын пипетка эсвэл хавтгай угаалтүүн ашиглаж үзэх ёстой.
• Сүвд агаарын бөмбөлөгүүд: Бөмбөлөгүүд ТМБ-ийн өнгөн хөгжилд нөлөөлнө — шингэн нэмж бүүрт нь хавтгайг тасалдаж үзэх ёстой.
• Сорилтын сэмплүүдийн хөлдөөх-хайлах тойргууд: Олон дахин хөлдөөх-хайлах тойргууд уургүүдийг газардуулж, илрүүлэх боломжтой антиген концентрацияг бууруулж, түүн дээр нь нөлөөлнө. Хөлдөөхөөс өмнө сэмплүүдийг хувааж үзэх ёстой.
• Реагентүүдийн температурт тогтмолжихыг алгасах: Хүйтэн реагентуудыг өрөөн температурт хавтанцагт нэмж өгөх нь хавтанцаг дээр тархмал бүх хэсгүүдэд илтгэлд нөлөөлөх температур градиент үүсгэнэ.
• Наборын форматыг бүрүүн тодорхойлох: Сэндвич-анализын стандарт муруйн томъёог орлуулалтын ELISA наборын үр дүнд хэрэглэх нь тайлбарыг урвуу хийнэ — өндөр сигнал нь үнэнд үл нийцэж, өндөр концентраци гэж тайлбарлагдана.

Амжилттай ELISA анализ хийх нь нарийн давтамжит ажиллах уралдааны дүрс. Хэрэв та нарийн ажиллах үед ч үр дүн хувьсах бол, наборын техникийн шинж чанарууд — мэдээлэлд суурилдаг мэдээлэл, баталгаажуулж үзсэн матрицууд, сорилт антителүүдийн хоорондын харилцан үйлчлэл — тааны тодорхой аналитик бодис ба сорилт зүйлд тохиромжтой юу гэдгийг үнэлэх цаг иржээ. Баталгаажуулж үзсэн хүний ELISA хайрцгийн үйлдвэрлэгч бүх партийн хоорондын тогтвортой бүтэц мэдээллийг баталгаажуулж үзсэн нүүрснээс үр дүнгүүдийг харьцуулахад хүндрэлгүй бөөрнө, учир нь та үр дүнгүүдийг тодорхой үндэсний түвшинд харьцуулах болой, ямар хувьсагч өөрчлөгдсөн гэдгийг таамаглах шаардлагагүй.